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Scientific Reports volume 6, numero articolo: 18741 (2016) Citare questo articolo

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ATM è un importante gene di suscettibilità al cancro che codifica per una chinasi apicale critica del percorso di risposta al danno del DNA (DDR). Mostriamo che un esone chiave di decadimento dell'RNA mediato da sciocchezze (NSE) in ATM è represso da U2AF, PUF60 e hnRNPA1. L'attivazione dell'NSE era specifica per l'aplotipo ed era maggiormente promossa dalla citosina in rs609261 nel sito di giunzione NSE 3′ (3′ss), che è predominante nelle popolazioni ad alto rischio di cancro. I livelli di NSE erano deregolamentati nelle leucemie e erano influenzati dall'identità del residuo 34 di U2AF35. Identifichiamo anche oligonucleotidi di commutazione di giunzione (SSO) che sfruttano la competizione di pseudoesoni adiacenti per modulare i livelli di NSE. L'utilizzo dell'esone regolato dall'U2AF nella via di segnalazione ATM era centrato sull'asse MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/ciclina-B e coinvolgeva preferenzialmente le trascrizioni implicate nelle fusioni geniche associate al cancro e nelle traslocazioni cromosomiche. Questi risultati rivelano importanti collegamenti tra il controllo dei 3 e le risposte dipendenti da ATM alle rotture del DNA a doppio filamento, dimostrano la plasticità funzionale delle varianti introniche e illustrano la versatilità degli SSO intronici che prendono di mira gli pseudo-3 per modificare l'espressione genica.

Gli introni vengono rimossi da un complesso RNA-proteina ampio e altamente dinamico chiamato spliceosoma, che orchestra interazioni complesse tra trascrizioni primarie, piccoli RNA nucleari (snRNA) e un gran numero di proteine1. Gli spliceosomi si assemblano ad hoc su ciascun introne in modo ordinato, iniziando con il riconoscimento del sito di giunzione 5' (5'ss) da parte dello snRNA U1 o dei 3′ss da parte della via U21,2, che comporta il legame del fattore ausiliario U2 ( U2AF) alla regione 3′ss per facilitare il riconoscimento U2 della sequenza dei punti di diramazione (BPS)3. U2AF è un eterodimero stabile composto da una subunità da 65 kD codificata da U2AF2 (U2AF65), che lega il tratto polipirimidinico (PPT) e una subunità da 35 kD codificata da U2AF1 (U2AF35), che interagisce con dinucleotidi AG altamente conservati a 3' ss e stabilizza il legame U2AF654. Oltre all'unità BPS/PPT e 3′ss/5′ss, uno splicing accurato richiede sequenze o strutture ausiliarie che attivano o reprimono il riconoscimento del sito di giunzione, note come potenziatori o silenziatori di giunzione intronici o esonici. Questi elementi consentono di riconoscere i siti di giunzione autentici tra un vasto eccesso di siti criptici o pseudo-siti nel genoma degli eucarioti superiori, che hanno sequenze simili ma superano i siti autentici di un ordine di grandezza5. Sebbene abbiano spesso una funzione regolatrice6, i meccanismi molecolari della loro repressione sono poco conosciuti.

Studi di sequenziamento dell'esoma hanno rivelato un modello ristretto di mutazioni somatiche in U2AF1/U2AF2 e altri geni coinvolti nel riconoscimento 3 nelle cellule tumorali, tra cui SF3B1, ZRSR2, SF1, SF3A1, PRPF40B e SRSF2 (rivisto in7). Questi geni codificano prodotti che spesso interagiscono durante l'assemblaggio dello spliceosoma8,9,10 e mostrano un alto grado di mutua esclusività delle mutazioni associate al cancro7, indicando l'esistenza di un percorso oncogenico condiviso. La profilazione del trascrittoma nelle leucemie portatrici di queste mutazioni ha rilevato numerose alterazioni nello splicing dei precursori dell'mRNA7, ma i collegamenti chiave tra specifici difetti di elaborazione dell'RNA e l'inizio o la progressione del cancro sono rimasti oscuri, nonostante la grande promessa di questi bersagli per la modulazione terapeutica. Inoltre, non è chiaro il motivo per cui il modello di mutazione altamente ristretto in queste cellule non sia stato associato a un insieme limitato e chiaramente definito di difetti di elaborazione dell'RNA con proprietà oncogene. Inoltre, l'utilizzo degli esoni nei geni DDR, attori critici nella trasformazione maligna, non è stato completamente caratterizzato nelle cellule prive di fattori di elaborazione 3′s e le varianti naturali del DNA che influenzano la loro attivazione erano sconosciute.

TAG>AAG>GAG hierarchy of exon inclusion levels at the 3′ss consensus15. To confirm that the NSE usage is allele-specific, we examined splicing of two reporter constructs that contained C or T at this position following transient transfections into HEK293 cells (Fig. 2b). As expected, the T construct yielded lower NSE inclusion than the C reporter, both in untreated cells and cells individually depleted of each U2AF subunit (Fig. 2c)./p>G13. We noticed that this mutation activated the NSE 3′ss while repressing its 5’ss and promoting a downstream 5’ss instead, introducing a 112-nt cryptic exon in the mRNA13. We also noticed that within this exon, there was a strong 3′ss consensus preceded by optimal BPS/PPT motifs, which may bind U2AF and activate a smaller, 24-nt pseudoexon (termed PE; Fig. 4a). Examination of published RNA crosslinking/immunoprecipitation data20 in ATM showed U2AF65 binding upstream and downstream of NSE and upstream of PE, suggesting that NSE activation may be controlled by competition between partially productive spliceosomes assembled at the PE 3′ss and the NSE 3′ss. The two 3′ss are conserved in mammals and are separated by a distance smaller than the minimal intron size, sterically preventing simultaneous recognition of NSE and PE (Fig. 4a). Deletion of the PE PPT/3′ss introduced in the C minigene, which should alleviate NSE repression through diminished U2AF binding to PE, increased NSE inclusion (Fig. 4b), in agreement with the 3′ss competition. This deletion also induced retention of the intron that separates NSE and PE, mimicking the splicing pattern of the A-T mutation IVS28-159A >G. Increasing the intron length from 59 to 79 nt, thereby overcoming a steric hindrance imposed by the insufficient distance between the two pseudo-3′ss, also improved NSE inclusion and diminished the intron retention (Fig. 4b)./p>G substitution13. In this A-T case, both NSE and PE were included in the ATM mRNA together with the intervening sequence. Canonical and aberrant transcripts are denoted by dotted lines above and below the pre-mRNA. Middle panel shows RNA-Seq read densities for NSE in cells depleted of both U2AF35 isoforms (ab-) together with U2AF65 tags/high-confidence binding sites (horizontal lines/rectangles) identified by crosslinking and immunoprecipitation20. The 100 basewise vertebrate conservation by Phylop (100 VC) is at the bottom. The lower panel shows mutations (in red and underlined) introduced in the C-minigene. (b) Splicing pattern of wildtype and mutated C minigenes. Mutations are at the bottom of panel (a); RNA products are shown schematically to the right. The largest product produced by clone PE delPPT/AG includes the shortened pseudointron. (c) Splicing pattern of C minigenes mutated in NSE (lanes 2, 3, 7 and 8) or PE (lanes 4, 5, 9 and 10) in (mock)-depleted HEK293 cells. Mutations are at the bottom; their sequences are in Table S2. Spliced products are schematically shown to the right. A hairpin symbol above PE denotes the MIR stem-loop insertion; cr3’ss, a cryptic 3’ss activation 7 nt downstream of the authentic NSE 3’ss. (d,e) SSO-induced pseudoexon switching. Transfected minigenes are shown at the top, spliced products to the right and SSOs at the bottom. SSO sequences are in Table S1. Final concentration of SSOs shown in panels (d–g) was 3, 10 and 30 nM. (f) PE SSOs induced NSE skipping. (g) SSOs targeting a sequence that activates NSE upon deletion (PEdelPPT/AG; panel a and b) inhibit PE. (h) NSE activation is haplotype-dependent. Minigene haplotypes at the indicated variants are at the bottom. Columns represent mean NSE inclusion, error bars are SDs, asterisks denote statistically significant differences as in Fig. 1b./p>TG > TA./p>

G62, despite targeting U2AF binding sites (Fig. 4a). This suggests that the morpholino blocked access to structures or motifs that are not responsible for exon activation, but exon repression, in agreement with our finding (Fig. 1a–c). Thus, administration of antisense-based RNA processing activators or inhibitors that target or avoid binding sites of splicing factors in introns could be exploited therapeutically to shape beneficial or detrimental consequences of NMD in cancer cells./p>